Développement de RT multiplex quantitatif

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12073 (2023) Citer cet article

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L'hépatite Delta est une maladie causée par l'exposition aux virus de l'hépatite B (VHB) et de l'hépatite D (HDV), généralement avec une issue clinique plus grave qu'une monoinfection par le VHB. À ce jour, la prévalence réelle de l’infection par le HDV est sous-estimée et les méthodes de détection sont peu disponibles, notamment dans les régions plus endémiques. Par conséquent, une méthode RT-qPCR en une étape pour la quantification de l’ARN-HDV a été développée. Des échantillons biologiques ont été sélectionnés entre 2017 et 2023 auprès de patients de l'Ambulatório Especializado em Hepatites Virais du Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia et du Serviço de Assistência Especializada et ont subi le test développé par cette étude et un deuxième test RT-qPCR quantitatif. La pente du test quantitatif initial était de − 3,321 avec une efficacité de 100,04 % et un facteur d'amplification égal à 2. L'analyse des données de répétabilité a révélé une limite de quantification de 5 copies/réaction et une limite de détection (95 %) de 2,83 copies par réaction. réaction. Dans les tests de sensibilité diagnostique, la précision était de 97,37 % par rapport au test de référence. Ce test s'est avéré très efficace et reproductible, ce qui en fait un outil précieux pour surveiller les patients atteints d'hépatite Delta et évaluer le risque de progression de la maladie, ainsi que l'efficacité du traitement.

Le virus de l'hépatite delta (HDV) classé dans le genre Deltavirus est atypique, présentant environ 1 700 nucléotides d'un seul brin d'ARN de polarité négative d'une taille comprise entre 36 et 43 nm et présente dans sa structure externe des protéines de surface du virus de l'hépatite B (VHB). )1,2. L'infection par le HDV est précédée d'une exposition antérieure, d'une infection actuelle ou simultanée au VHB. Habituellement, son évolution clinique sera plus sévère, caractérisée par une progression accélérée vers une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire par rapport à la mono-infection par le VHB3,4,5.

Il est actuellement difficile d’estimer avec précision la prévalence du HDV dans le monde ; au moins 12 à 15 millions de personnes pourraient être infectées par le virus, réparties en Afrique, en Asie, aux Amériques, en Méditerranée orientale et en Europe6,7. En Amérique du Sud, la zone d’endémie du HDV est située au nord (région du bassin amazonien) et couvre plusieurs pays5,8,9,10. Au Brésil, entre 2000 et 2021, le nombre de cas signalés était de 4 259. Ces chiffres peuvent être considérés comme sous-estimés puisque cette maladie reste négligée dans tout le pays et qu’il n’y a pas de recherche active de patients mono-infectés par le VHB pour déterminer les co-infections11.

Le diagnostic sérologique de l'infection par le HDV repose sur la détection des anticorps totaux anti-HDV dans le sérum. La présence d'HDAg dans le tissu hépatique est également un indicateur clinique qui permet de confirmer l'infection par élastographie hépatique, une méthode non invasive et indolore qui permet d'évaluer le degré de fibrose hépatique4,12. Une fois les anticorps anti-HDV détectés, un diagnostic moléculaire est utilisé pour confirmer ou exclure une infection active. Le test moléculaire est réalisé par recherche de l'ARN du HDV dans le plasma, quantifié par la méthode RT-qPCR ; cependant, ce n’est pas conventionnel puisqu’il n’existe aucun kit enregistré auprès de l’Agence brésilienne de surveillance de la santé (Anvisa). L’utilisation de méthodes moléculaires pour quantifier le HDV dans des zones restreintes où des professionnels spécialisés peuvent développer des tests en interne constitue également un facteur limitant13.

Par conséquent, le diagnostic moléculaire du HDV reste un défi car il n’est pas largement disponible dans les zones endémiques de la région amazonienne. Le but de l'étude était de développer un test RT-qPCR multiplex quantitatif en une étape à haute sensibilité pour le diagnostic et le suivi des patients atteints d'hépatite Delta.

Le plasmide a été testé à des intervalles de 1 × 105 et 1,25 copies par réaction (1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102, 1 × 101, 5, 2,5 et 1,25), pour déterminer l'efficacité et la linéarité de l'amplification. Tous les points de la courbe de quantification au-dessus de 5 copies par réaction présentaient une amplification de 100 % dans différents tests. La pente du test quantitatif initial était de − 3,321 avec une efficacité de 100,04 %, un coefficient de corrélation de la droite (R2) égal à 0,99 et un facteur d'amplification égal à 2 (voir Fig. 1).